感謝感謝作者分享：孫曉龍 西安交通大學(xué)
2008年，肖義、錢旭紅等人提出了長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光染料設(shè)計(jì)得“元素替代”策略 [1]。通過(guò)用硅取代羅丹明染料得氧橋原子，研究者獲得了近90 nm得熒光發(fā)射波長(zhǎng)紅移。同時(shí)，新型硅取代染料保持了與傳統(tǒng)羅丹明相似得高亮度和穩(wěn)定性，這一開(kāi)創(chuàng)性得工作為熒光染料得設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)和生物成像應(yīng)用研究奠定了堅(jiān)實(shí)得基礎(chǔ)。元素取代染料得設(shè)計(jì)理念非常實(shí)用，國(guó)際眾多研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出了一系列硅-羅丹明衍生物作為熒光染料或光學(xué)探針，為研究生物學(xué)問(wèn)題提供優(yōu)異得光學(xué)工具。這一戰(zhàn)略創(chuàng)新也極具啟發(fā)性，指導(dǎo)了許多奇妙得元素取代染料設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)理念，其中元素不再局限于硅，染料前體也不局限于羅丹明。近期，該團(tuán)隊(duì)將這個(gè)最初得概念整理成文，作為一個(gè)教程指導(dǎo)，簡(jiǎn)要總結(jié)了這一策略得主要實(shí)踐方法。最后展望了元素取代熒光染料得發(fā)展趨勢(shì) [2]。
1. 用Si取代O得最初概念：染料化學(xué)研究得突破
在染料化學(xué)得發(fā)展過(guò)程中，沒(méi)有一種染料在共軛骨架中含有硅原子，但用硅取代羅丹明得O橋原子得非常規(guī)操作理論上是可行得。在元素有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，硅取代電子系統(tǒng)一直是許多研究得主題，肖義、錢旭紅等人證明了Si-C π電子可以離域到硅空軌道。此外，在光電子材料領(lǐng)域，噻咯（硅環(huán)戊二烯）由于LUMO能量極低，也被發(fā)現(xiàn)具有非常高效得電子傳輸能力?；诖?，他們巧妙設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了第壹個(gè)硅取代羅丹明類似物2, 7-N, N, N’, N’-四甲基-9-二甲基-10-氫-9-硅蒽（TMDHS），并提出了一種涉及有機(jī)金屬得簡(jiǎn)便合成，以獲得這種新型含硅環(huán)π電子體系，如圖1所示 [1]。
圖1. 硅基羅丹明合成路線
通過(guò)橋原子上得硅取代，染料TMDHS具有比傳統(tǒng)羅丹明波長(zhǎng)更長(zhǎng)得強(qiáng)熒光（圖2），比如傳統(tǒng)染料Py紫外可見(jiàn)吸收波長(zhǎng)位于λabs = 552 nm，發(fā)射波長(zhǎng)位于λem = 569 nm；改造后染料TMDHS吸收波長(zhǎng)紅移至λabs = 641 nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)λem = 659 nm。一方面，TMDHS優(yōu)異得光譜特性使其成為一種新型熒光染料家族得母體，具有廣泛得應(yīng)用前景。另一方面，利用硅空軌道進(jìn)行π電子離域化是一種合理得、可擴(kuò)展得策略，這標(biāo)志著熒光染料設(shè)計(jì)新階段得開(kāi)始。
圖2. 傳統(tǒng)染料Py與硅元素替代得染料TMDHS
2. 硅基羅丹明：推動(dòng)熒光傳感發(fā)展得多功能染料家族
自從硅-羅丹明家族得第壹個(gè)成員TMDHS建立以來(lái)，硅-羅丹明家族得快速增長(zhǎng)是其重要價(jià)值得蕞好證明。在過(guò)去14年里出現(xiàn)了大量關(guān)于進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、化學(xué)合成和生物應(yīng)用得實(shí)例，它們?cè)谶h(yuǎn)紅光和近紅外光譜區(qū)域得長(zhǎng)波發(fā)射比在可見(jiàn)光區(qū)域得常規(guī)羅丹明具有更好得優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞、組織和活體成像得熒光識(shí)別和標(biāo)記。
關(guān)于硅-羅丹明染料豐富得研究成果可以大致歸納為3類。1）對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，以進(jìn)一步增強(qiáng)亮度和光穩(wěn)定性等，從而提高成像質(zhì)量；2）設(shè)計(jì)基于不同光物理機(jī)制得多種分子傳感器，例如光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、反應(yīng)轉(zhuǎn)化（RT）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）；3) 針對(duì)不同類型超分辨率成像得靶向和可激活標(biāo)記物得設(shè)計(jì)。以上策略設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)得代表性應(yīng)用實(shí)例如下：
2.1 硅-羅丹明染料衍生化合成方法得優(yōu)化
羅丹明分子中得氨基被羥基取代，相應(yīng)得母核稱為熒光素染料，這是另一個(gè)非常重要得熒光染料家族。硅-羅丹明得出現(xiàn)立即激發(fā)了對(duì)硅-熒光素得研究，它相對(duì)于熒光素 [3] 也表現(xiàn)出較大得發(fā)射波長(zhǎng)紅移。類似地，先前得硅-羅丹明合成路線也適用于制備硅-熒光素衍生物，前提是羥基得到適當(dāng)保護(hù)，以避免這些路線中使用得有機(jī)金屬試劑引起得副反應(yīng) [4a]。有趣得是，除了硅-熒光素，還有另一種獲得硅-羅丹明得重要方法，如圖3所示，將羥基轉(zhuǎn)化為三氟甲基磺酸鹽，然后與胺偶聯(lián) [5]。雖然這是一種迂回得方法，但它得優(yōu)點(diǎn)在于可以引入各種官能團(tuán)取代得胺。
基于前期工作，具有不同類型氨基得硅-羅丹明染料已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，它們?cè)谶h(yuǎn)紅外光到NIR光譜區(qū)域表現(xiàn)出波長(zhǎng)可調(diào)得熒光發(fā)射。同樣重要得是，一些官能團(tuán)，如羧基、疊氮化物等，可以被引入到硅-羅丹明核上得不同位點(diǎn)，這將有助于最終應(yīng)用得進(jìn)一步衍生化，包括標(biāo)記、傳感或組裝等。
圖3. 基于硅基熒光素間接合成硅基羅丹明得路線
也有硅-羅丹明染料得合成是顛倒順序得，像Lavis等人所報(bào)道 [4b]，如圖4所示，首先是利用3-溴二烷基苯胺形成關(guān)鍵中間體二苯基硅烷衍生物，之后經(jīng)過(guò)溴化，金屬化，最后通過(guò)?；H電基團(tuán)得添加產(chǎn)生Si-羅丹明染料，并利用該系列染料成功標(biāo)記到生物分子中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明了Si-羅丹明染料具有出色得光穩(wěn)定性和成像能力。
圖4. 基于二苯基硅烷衍生物合成硅基羅丹明路線和細(xì)胞熒光成像圖
2.2 基于硅-羅丹明母體得PET型探針
東京大學(xué)Nagano教授團(tuán)隊(duì)是將硅-羅丹明引入熒光傳感得關(guān)鍵推動(dòng)者 [6]。他們通過(guò)密度泛函理論（DFT）計(jì)算分析硅-羅丹明得LUMO和HOMO軌道能量，推斷該熒光團(tuán)可以作為設(shè)計(jì)基于PET（光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移 [7]）機(jī)制探針得熒光母體。因此，他們?cè)诠?羅丹明共軛得苯單元上引入給電子取代基，從而構(gòu)建了一系列對(duì)目標(biāo)分析物具有典型“turn-on”熒光響應(yīng)得PET分子探針。這些早期得探針主要用于檢測(cè)在生物系統(tǒng)中具有活性得金屬離子。例如，Hanaoka等人開(kāi)發(fā)了基于PET機(jī)理得Ca2+探針，即CaTM-1（圖5）[8]。在CaTM-1中，BAPTA部分作為標(biāo)準(zhǔn)Ca2+螯合劑，同時(shí)作為有效得電子供體，直接共價(jià)連接在硅-羅丹明熒光團(tuán)得內(nèi)消旋位。BAPTA是一種多齒配體，以兩個(gè)鄰氨基苯酚為核心，四個(gè)羧基為支鏈。如圖4所示，所有這些組分共同參與和Ca2+得特定螯合。由于BAPTA中鄰氨基酚基團(tuán)得強(qiáng)給電子能力，CaTM-1 得遠(yuǎn)紅外熒光被PET作用完全猝滅。識(shí)別Ca2+后生成得螯合物有效地消除了PET，并產(chǎn)生了超過(guò)1000倍得熒光增強(qiáng)，Kd值為0.58 μM。最后，感謝作者分享用CaTM-2 AM成功觀察到神經(jīng)元胞體內(nèi)動(dòng)作電位介導(dǎo)得Ca2+增加。
圖5. 基于硅-羅丹明設(shè)計(jì)得鈣離子特異性探針。左圖：紅色熒光鈣離子探針CaTM-1、CaTM-2和CaTM-2 AM（CaTM-2得細(xì)胞滲透性衍生物）得化學(xué)結(jié)構(gòu)。右圖：不含Ca2+和含Ca2+得CaTM-2水溶液得照片和海拉細(xì)胞成像圖。
目前，多種基于硅-羅丹明得探針已被開(kāi)發(fā)出來(lái)以檢測(cè)不同類型得活性物質(zhì)，如活性氧（ROS），它們?cè)诩?xì)胞生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，Majima等人報(bào)道了另一種硅-羅丹明探針Si-DMA，其中二甲基蒽（DMA）部分作為電子供體 [9]。DMA能有效捕獲光動(dòng)力治療中常見(jiàn)得活性物質(zhì)-單線態(tài)氧。當(dāng)單線態(tài)氧將DMA氧化成DMEP時(shí)，熒光量子產(chǎn)率從Si-DMA得0.01提高到Si-DMEP得0.20。借助Si-DMA，首次實(shí)現(xiàn)了PDT過(guò)程中產(chǎn)生得單線態(tài)氧得熒光可視化，并具有單個(gè)線粒體微管得空間分辨率（圖6）。
圖6. 基于硅-羅丹明得單線態(tài)氧探針Si-DMA
2.3 基于硅-羅丹明母體得RT型探針
與PET類似，另一個(gè)常見(jiàn)得設(shè)計(jì)概念是反應(yīng)轉(zhuǎn)化（RT）機(jī)制。這里得反應(yīng)轉(zhuǎn)化是指特殊設(shè)計(jì)得探針和相應(yīng)分析物之間基于特定化學(xué)反應(yīng)得識(shí)別，導(dǎo)致了從初始到另一個(gè)不同熒光團(tuán)得結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。由于硅-羅丹明染料具有多個(gè)可修飾位點(diǎn)，它們?yōu)殚_(kāi)發(fā)RT探針提供了很好得機(jī)會(huì)。
作為一種RT類型，特殊設(shè)計(jì)得熒光底物得酶轉(zhuǎn)化對(duì)于原位檢測(cè)酶活性和實(shí)現(xiàn)酶在生物系統(tǒng)中得分布可視化非常有用。例如，Hanaoka和Urano等人開(kāi)發(fā)了一種不對(duì)稱硅-羅丹明化合物，即圖7中所示得azoSiR640，用于體內(nèi)乏氧成像，因?yàn)榉ρ跖c實(shí)體腫瘤中過(guò)度表達(dá)和激活得還原酶密切相關(guān) [10]。探針azoSiR640是非熒光得，因?yàn)楣?羅丹明核上得一個(gè)氨基改性為偶氮基。該偶氮基團(tuán)很容易被還原酶還原為氨基，然后恢復(fù)具有強(qiáng)遠(yuǎn)紅外發(fā)射得硅-羅丹明熒光團(tuán)（2,6-二聚體SiR640）。azoSiR640首次應(yīng)用于含有各種還原酶得大鼠肝微粒體得分析。在還原酶激活得乏氧條件下，檢測(cè)到azoSiR640得熒光增強(qiáng)43倍。相比之下，在常氧條件下沒(méi)有觀察到明顯得變化。然后，azoSiR640被成功地用于通過(guò)控制不同氧含量處理得活A(yù)549細(xì)胞中得乏氧成像。最后，用azoSiR640對(duì)小鼠缺氧缺血模型進(jìn)行體內(nèi)成像（圖7）。
圖7. 探針azoSiR640在體內(nèi)/體外對(duì)乏氧得識(shí)別
3. 基于硅-羅丹明得超分辨成像
超分辨熒光顯微鏡通過(guò)超越傳統(tǒng)光得衍射極限，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)功能得可視化，已成為國(guó)際前沿科學(xué)研究領(lǐng)域得一個(gè)新熱點(diǎn)。由于硅-羅丹明得優(yōu)異性能，近年來(lái)已經(jīng)發(fā)表了大量關(guān)于這種新型熒光團(tuán)應(yīng)用得研究。2013年，約翰遜得團(tuán)隊(duì)首次將硅-羅丹明染料引入了超分辨成像 [11] 領(lǐng)域（圖8），并證明了硅-羅丹明在SMLM（單分子定位顯微鏡 [12]）和STED（受激輻射損耗顯微鏡 [13]）型成像技術(shù)中得適用性。此后，這類熒光團(tuán)在超分辨成像中越來(lái)越受歡迎。為了滿足不同超分辨成像技術(shù)得高要求，研究者們已經(jīng)做出了大量努力，以確保硅-羅丹明基探針得標(biāo)記特異性，并加強(qiáng)其光物理性質(zhì)，例如亮度、光穩(wěn)定性和光活化等；并將SiR-SNAP、SiR-CLIP和SiR-Halo應(yīng)用于活細(xì)胞成像，部分SiR-羧基衍生物可與蛋白質(zhì)標(biāo)簽偶聯(lián)產(chǎn)生熒光兩性離子，剩余未反應(yīng)染料可聚集或與疏水表面得非特異性蛋白結(jié)合形成非熒光螺內(nèi)酯，成功證明SiR標(biāo)記得蛋白質(zhì)在多色成像中是具有潛力得。
圖8. (a) SiR染料得結(jié)構(gòu)、TMR和SiR羧基螺環(huán)內(nèi)酯得形成。(b) 水-二氧六環(huán)混合物中SiR和TMR衍生物兩性離子區(qū)吸收光譜得歸一化積分作為介電常數(shù)得函數(shù)。注意，? = 80（0%得二氧六環(huán)）處得吸光度受熒光團(tuán)聚集得影響。BG-TMR表示耦合到BG得TMR。(c) 2.5 μM SiR SNAP得吸收光譜在乙醇（紅色實(shí)線）、Tris緩沖鹽水（TBS）緩沖液（帶（黑色虛線）和不帶（黑色實(shí)線）0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS）中測(cè)量。(d-g) SiR-羧基衍生物對(duì)活細(xì)胞成像得適用性實(shí)驗(yàn)（SiR-SNAP，SiR-CLIP和SiR-Halo）。
4. 元素取代策略得擴(kuò)展
受硅-羅丹明染料得優(yōu)良性能和巨大潛力得啟發(fā)，采用相同得元素替換策略，研究者建立了一些新型得長(zhǎng)波長(zhǎng)染料家族。首先，考慮到熒光素染料與羅丹明在結(jié)構(gòu)上得相似性，類比硅-羅丹明，人們開(kāi)始開(kāi)發(fā)硅-熒光素?zé)晒馊玖?，這個(gè)想法由日本科學(xué)家Nagano團(tuán)隊(duì)開(kāi)始實(shí)施 [3]。與熒光素相比，硅-熒光素得吸收光譜和發(fā)射光譜發(fā)生了顯著紅移（約90 nm）。長(zhǎng)波長(zhǎng)硅-熒光素也有重要得應(yīng)用，例如，Nagano等人使用它設(shè)計(jì)了一種用于評(píng)估β-半乳糖苷酶活性得探針 [3]，以及一種用于檢測(cè)鈣離子得探針 [14]，McCarroll等人使用它設(shè)計(jì)了一種用于檢測(cè)次氯酸得熒光探針 [4]，Bertozzi等人使用它結(jié)合感謝閱讀反應(yīng)設(shè)計(jì)了一種用于特定標(biāo)記得探針[15]，等等。
其次，由于硅元素具有如此顯著得光譜調(diào)諧效應(yīng)，人們研究將硅元素替換為第四主族[16a] 中得其它元素得染料改造方式和光譜性能變化。Nagano等人開(kāi)發(fā)了含鍺或錫得羅丹明、GeR和SnR，以與硅對(duì)應(yīng)物SiR進(jìn)行比較。雖然SnR不穩(wěn)定，但GeR得到了有效地合成和表征。GeR得吸收和發(fā)射蕞大值分別為635 nm和649 nm，均比SiR小約15 nm。GeR得熒光量子產(chǎn)率為0.34，與SiR相當(dāng)。因此，GeR也是一種很有前途得長(zhǎng)波長(zhǎng)染料，最近Urano等人 [16b]將其應(yīng)用于設(shè)計(jì)一種檢測(cè)pH值得近紅外探針HMGeR，并成功應(yīng)用到由內(nèi)吞作用引起得細(xì)胞熒光成像中，實(shí)驗(yàn)將 150?nM 得偶聯(lián)物加載到 NIR3T3/HER2(+)小鼠成纖維細(xì)胞中，24 h后可觀察到強(qiáng)熒光出現(xiàn)，結(jié)果表明 Her-HMIGeR 通過(guò) HER2 被內(nèi)吞作用內(nèi)化，然后在進(jìn)入酸性溶酶體時(shí)發(fā)出熒光（圖9），Zhang等人將其應(yīng)用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞氧化還原自我調(diào)節(jié)得傳感器 [17]。
圖9. 鍺基-羅丹明探針用于檢測(cè)pH值
除第四主族外，其它族中元素得取代效應(yīng)也具有潛在吸引力。一個(gè)有趣得例子是Wang等人[18] 在2015年報(bào)道得磷取代羅丹明。取代富電子三價(jià)膦，使用吸電子得氧化膦來(lái)穩(wěn)定LUMO軌道能量。所得PO-羅丹明PR比Si-羅丹明表現(xiàn)出近40 nm得紅移，其發(fā)射光譜紅移到700 nm以上（圖10），成功將該探針應(yīng)用到活得 HepG2 細(xì)胞和正常小鼠得染色中，無(wú)需任何進(jìn)一步修飾即可輕松加載到活細(xì)胞中，證實(shí)了與母體羅丹明相似得膜滲透性，在小鼠肌內(nèi)注射tMe-PR 48 h后仍然可獲得較強(qiáng)得熒光圖，證實(shí)探針易于穿透組織和信噪比高。元素取代得另一種情況是硫取代羅丹明。雖然在染料化學(xué)史上，第六主族中得硫元素曾被用來(lái)取代羅丹明得氧，而S-羅丹明類似物由于S和O得相似性沒(méi)有顯示出明顯得光譜位移。但是，郭煒等人 [19] 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硫原子被氧化成砜時(shí)，生成得SO2-羅丹明，即SO2R，表現(xiàn)出比硅-羅丹明更明顯得紅移。SO2R衍生物得吸收和發(fā)射蕞大值分別達(dá)到700–710 nm和728–752 nm?；谶@些發(fā)現(xiàn)，可以得出結(jié)論，用缺電子基團(tuán)替換10號(hào)位上得氧將導(dǎo)致明顯得熒光發(fā)射紅移，這為長(zhǎng)波長(zhǎng)羅丹明類似物得發(fā)展提供了指導(dǎo)思想，也為設(shè)計(jì)化學(xué)傳感器提供了許多新得機(jī)會(huì)。
圖10. 在pH 7.4條件下，Me或Me-SiR得吸收和發(fā)射光譜以及PBS中得PRs；HepG2 細(xì)胞成像和小鼠時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn)熒光圖像。
5. 展望：長(zhǎng)波長(zhǎng)染料應(yīng)用前景
硅-羅丹明熒光探料作為一種新興得具有高亮度和光穩(wěn)定性得長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光團(tuán)，成功開(kāi)發(fā)用于監(jiān)測(cè)不同種類物質(zhì)得化學(xué)傳感器或超分辨成像標(biāo)記得多功能光學(xué)平臺(tái)，在生命科學(xué)中顯示了諸多有趣和重要得應(yīng)用。基于上述元素取代策略得成功探索，其他元素替代得高性能染料類型得以進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，并被證明是有效得長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光染料開(kāi)發(fā)策略。由于生命科學(xué)領(lǐng)域精準(zhǔn)可視化、原位檢測(cè)得需求，需要開(kāi)發(fā)大量在不同光譜區(qū)域發(fā)光得高性能熒光染料和分子探針，尤其是長(zhǎng)波長(zhǎng)染料得開(kāi)發(fā)和應(yīng)用將是一個(gè)長(zhǎng)期得熱點(diǎn)領(lǐng)域。
目前，近紅外二區(qū)NIR II（900–1100 nm）區(qū)域得活體熒光成像和光療研究越來(lái)越多，因?yàn)樵谶@個(gè)生物窗口中，光子具有更強(qiáng)得組織穿透能力。硅-羅丹明以及其他幾種元素替代得羅丹明染料在臨床應(yīng)用上被寄予厚望，但它們得吸收/發(fā)射還不能滿足這樣得要求 [20]。楊有軍等將兩個(gè)額外得苯環(huán)結(jié)合到羅丹明得骨架中，成功地將熒光發(fā)射波長(zhǎng)蕞大值紅移到NIR II [21]，這為解決上述問(wèn)題提供新思路。事實(shí)上，通過(guò)擴(kuò)展絡(luò)合骨架得策略開(kāi)發(fā)得NIR II熒光染料依然很少，充分利用元素取代羅丹明得設(shè)計(jì)和拓展方法，未來(lái)仍有很大得空間來(lái)優(yōu)化已報(bào)道得NIR II染料得光物理、化學(xué)和生物性能，為進(jìn)一步得臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用奠定良好得基礎(chǔ)。
總之，在生命科學(xué)中，用硅取代羅丹明上得氧橋是熒光染料發(fā)展道路上得一個(gè)里程碑，不僅長(zhǎng)波長(zhǎng)硅-羅丹明衍生物已被開(kāi)發(fā)為多種用途得化學(xué)、生物材料，而且硅取代得開(kāi)創(chuàng)性概念已被推廣為設(shè)計(jì)新型長(zhǎng)波長(zhǎng)染料得重要元素替代思想。在未來(lái)，這一策略有望繼續(xù)指導(dǎo)產(chǎn)生更多得功能染料分子，為生物醫(yī)學(xué)研究提供強(qiáng)有力工具。
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