尿素結(jié)合緩沖溶液
8M 尿素
20mM 咪唑
500mM NaCI
1mM 2-巰基乙醇
20mM Tris-HCI
復(fù)性緩沖溶液20mM 咪唑
500mM NaCI
1mM 2-巰基乙醇
20mM Tris-HCI
Tris洗脫緩沖溶液
500mM 咪唑
500mM NaCI
1mM 2-巰基乙醇
20mM Tris-HCI
實(shí)驗(yàn)方案：1、用低流速將樣品結(jié)合在Ni柱上。
2、用10倍柱體積得尿素結(jié)合緩沖液洗柱。
3、以百分百得尿素結(jié)合緩沖溶液到百分百復(fù)性緩沖溶液得線性梯度經(jīng)60min以0.5ml/min速度流過柱子。
4、以百分百得復(fù)性緩沖溶液到百分百Tris洗脫緩沖液得線性梯度流經(jīng)柱子。
5、蛋白純度檢測：SDS-PAGE。
備注：1、尿素緩沖溶液得配制：稱取尿素，加入2M 咪唑、1M Tris-HCI（pH 8.0）和水至90%終體積。加熱容器（因變性劑會溶解吸熱致冷），用45度水浴加熱至室溫并攪拌溶解。調(diào)節(jié)PH，加水至終體積。用前立即加入2-巰基乙醇。
2、含有鹽酸胍得樣品不能直接使用SDS-PAGE檢測，因?yàn)镾DS會使鹽酸胍沉淀。含有尿素得樣品不需要除掉尿素就可以直接用SDS-PAGE進(jìn)行分析。
參考文獻(xiàn)：《蛋白質(zhì)組學(xué)中得蛋白質(zhì)純化手冊》
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